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cck8試劑實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的疑難解答（二）
點(diǎn)擊次數(shù)：8230 更新時(shí)間：2018-03-22
1.哪些物質(zhì)會(huì)影響cck8試劑的測(cè)定？
當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK8的測(cè)定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測(cè)定)。在有酚紅存在的情況下，會(huì)增加空白吸收，但不影響測(cè)定，扣除空白吸收即可。
2.在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？
可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短為1小時(shí)。
3.設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是什么？必須設(shè)定嗎？
不一定要設(shè)定。cck8試劑在參比波長(zhǎng)沒(méi)有吸光度。設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來(lái)的吸收。
4.說(shuō)明書上僅寫了96孔板的測(cè)定方法，如果使用24孔板貨12孔板，應(yīng)該加多少量cck8試劑？
一般情況下建議加入cck8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。
5.在cck8試劑顯色過(guò)程中，如何終止反應(yīng)？
有一下幾種方法（96孔板）： 1、 在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)測(cè)定。
6.必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？
不一定。如果要向保持細(xì)胞的狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會(huì)不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)時(shí)需要統(tǒng)一檢測(cè)條件。
7.如果加入的藥物中含有金屬，是否會(huì)有影響？
金屬對(duì)cck8試劑顯色有影響。當(dāng)終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 Mm的話，將會(huì)100%抑制。
8.cck8試劑的保存條件？
在避光條件下cck8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長(zhǎng)時(shí)間的話，推薦在-20℃下保存。但是cck8試劑若反復(fù)解凍和冰凍將會(huì)增加空白吸收，從而影響檢測(cè)結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。
9.預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎？
一般情況下用胰蛋白酶處理對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì)數(shù)盤進(jìn)行計(jì)數(shù)。
10.cck8試劑對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？
不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入cck8試劑培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過(guò)延長(zhǎng)cck8試劑的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來(lái)解決。
11.懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？
懸浮細(xì)胞由于染色比較困那，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。貼壁細(xì)胞染色比較容易，若細(xì)胞數(shù)量過(guò)大，有時(shí)吸光度會(huì)超過(guò)酶標(biāo)儀的讀數(shù)。
12.應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？
建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對(duì)于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號(hào)不一樣，靈敏度可能會(huì)有輕微的差異，對(duì)于不同的批號(hào)建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
13.有時(shí)在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計(jì)算細(xì)胞數(shù)量？
不能。由于cck8試劑是通過(guò)和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量，如果細(xì)胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測(cè)定的細(xì)胞數(shù)量將會(huì)比真實(shí)值高，不能真實(shí)反映活細(xì)胞數(shù)量，建議采用別的方法測(cè)定。
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